Hogyan működik a genomszekvenátor?

Forrás: RocheForrás: Roche
Daganatok.hu 2010. október 14.
Megosztás:

Az utóbbi években gyors ütemben bővül azon tudományos vizsgálatok, nemzetközi kutatási programok köre, amelyek az emberi faj genetikai állományának feltérképezését szolgálják. Az első teljes géntérképek elkészülte után a figyelem az egyes gének különféle változatai (mutációi) és ezek kölcsönhatásai felé fordult: mely mutációk vagy mutációkombinációk okoznak betegségeket (pl. rákot), miben különbözik egy adott gyógyszerre reagáló és nem reagáló sejtek genetikai állománya? Ebben a munkában jelentenek komoly segítséget a már hazánkban is működő új generációs szekvenátorok (genomszekvenátorok). Hogyan végzik az örökítőanyag vizsgálatát ezekkel az eszközökkel?

Az iménti kérdések megválaszolásához DNS-mintára van szükség, ami - a vizsgálat céljától függően - származhat a vérből, a beteg szövetekből, vagy akár a szájnyálkahártyából származó egészséges sejtekből. A mintában lévő örökítőanyag bázissorrendjét lehet később kémiai, majd számítógépes módszerekkel elemezni. Mivel egyetlen kettős láncú DNS-molekula mérete rendkívül kicsi, önmagában még nem elemezhető - ehhez előbb fel kell sokszorozni a vizsgálni kívánt DNS-szakaszokat.

A DNS megkettőződése a saját szervezetünkben is naponta lezajlik a sejtosztódás folyamatának részeként, a DNS-polimerázoknak nevezett enzimek segítségével. Az eredeti, kettős szálú DNS-molekula ilyenkor előbb szétnyílik, majd a szétbontott szálakhoz - a bázisok folyamatos beépülésével - egy kiegészítő (komplementer) szál csatlakozik. A polimeráz enzimek egy speciális, baktériumokban előforduló hőtűrő változatával elérhető, hogy mesterséges körülmények között, hőmérsékletek ciklikus változtatásával, egymás után többször is végigvihető legyen ez a másolási folyamat. A kiválasztott DNS-darab sokszori lemásolásával már rengeteg DNS-darabkához jutunk, és az így nyert, egymással teljesen megegyező DNS-szakaszok kémiai felépítése immár meghatározható.

Hogyan épül fel a DNS?

A DNS kétszálú molekula: két egymással szemben elhelyezkedő és ellentétes irányba futó, spirálisan felcsavarodott lánc (kettős helix) alkotja. A láncok négyféle építőelemből, ún. nukleotidból épülnek fel, ezek egymástól csak a bennük lévő szerves bázisban különböznek, így a láncok bázissorrendje hordozza a genetikai információt. Ez a négy bázis: az adenin (A), a guanin (G), a citozin (C) és a timin (T). Az örökítőanyagunkban kódolt információ tehát leírható egy négybetűs ABC-vel. A kétszálú DNS-t úgy kell elképzelnünk, mintha két (négybetűs ABC-vel írott) "szöveg" lenne egymásra fektetve. Ezek - a molekula kémiai sajátosságai miatt - pontosan ellentétei (komplementerei) egymásnak, ez biztosítja a bonyolult molekula másolhatóságát és viszonylagos stabilitását. Az egyik "szöveg" A-betűivel szemben a másik "szövegben" mindig T-betűk, a C-betűkkel szemben pedig kötelezően G-betűk szerepelnek.

Géneknek a DNS azon szakaszait nevezik, amelyek egy-egy meghatározott fehérje előállításáért felelősek. A génekből - az egyén által hordozott mutációktól függően - különféle változatok lehetnek jelen a genetikai állományunkban, és ezektől is függ, hogy valakinél például mekkora eséllyel fejlődik ki a jövőben daganatos betegség.

Kisfilm a DNS felépítéséről és működéséről, a fehérjék szintéziséről (magyar felirattal):

A vizsgálat alapja a polimeráz láncreakció

A genomszekvenátorok működési elve az úgynevezett polimeráz-láncreakción alapul. Ez a módszer teszi lehetővé, hogy a rendelkezésre álló, kicsiny mennyiségű DNS-mintát az elemzésre alkalmas állapotba hozzák, vagyis felsokszorozzák. A molekuláris szintű diagnosztikában is ez a módszer jelentette az első igazi áttörést - az eljárás kifejlesztéséért 1993-ban kémiai Nobel-díjat adtak. A polimeráz-láncreakció megalkotását a Yellowstone Nemzeti Park hőforrásaiban élő baktériumok azonosítása tette lehetővé. A Thermophilus aquaticus baktériumok nagyon magas hőmérsékleten is életképesek, a DNS-t megkettőző polimeráz enzimjeik pedig szintén hőtűrőek, és 100 Celsius-fok közelében sem romlanak el.

A DNS mesterséges úton történő megsokszorozásához éppen ekkora hőmérsékletre van szükség. Az enzimeket és a vizsgálni kívánt DNS-mintát a genomszekvenátorba helyezik, és az elegyet körülbelül 95 Celsius fokos hőmérsékletűre melegítik fel. A DNS kettős hélixe ezen a hőmérsékleten két különálló szálra válik szét. Miután ez megtörtént, 68 Celsius fokra hűtik a belső hőmérsékletet. A DNS-polimeráz enzimek ekkor "kipótolják" a hiányzó szál bázisait, így újra kettősszálú nukleinsav-molekulák keletkeznek. A fűtés és a hűtés ciklusait akár negyvenszer is megismétlik egymás után, ami végül többmillió kettősszálú DNS-molekulát eredményez (ezt nevezik felszaporításnak, vagy idegen szóval amplifikációnak). A genomszekvenálást megelőzően a folyamat miniatűr cseppecskékbe zárt gyöngyökön zajlik, amelynek eredményeként minden egyes gyöngy egyetlen DNS szakasz nagyszámú kópiáját tartalmazza.

Videoklip a PCR-ról:

A bázissorrend-meghatározás (génszekvenálás) apró "kémcsövekben" zajlik

A vizsgálat további lépései a genomszekvenátor úgynevezett vizsgálótálcáján zajlanak. Ez egy fémbevonatú sima üveglapra hasonlít, amelynek a fémbevonatán néhány mikrométer széles miniatűr lyukak (cellák) találhatók lépsejtszerű elrendezésben. A most már megfelelő mennyiségben rendelkezésre álló DNS-darabokat először ismét egyszálúvá alakítják, majd a miniatűr cellákba helyezik.

Mindez továbbra is a gyöngyök közreműködésével zajlik, ezek mérete frappánsan pont akkora, hogy egy cellába mindössze egyetlen gyöngy fér el, így biztosítva, hogy egy adott cella csak azonos bázissorrendű DNS-szálakat tartalmazzon.

Gyöngy, felületén a DNS szálakkal

Az egyszálú DNS-ekből enzimek és kívülről hozzáadott bázisok segítségével újra kétszálú DNS-molekulákat szintetizálnak. Mindez úgy megy végbe, hogy sok egymás utáni menetben a négyféle nukleotid (A, T, C, G) valamelyikét adják csak hozzá az elegyhez. A csövecskékben zajló kémiai reakciók fényfelvillanásokkal jelzik, ha beépült egy-egy bázis a DNS-láncba. A fényfelvillanásokat egy szuperérzékeny kamera cellánként érzékeli és rögzíti: ez ad információt arról, hogy egy cellában az éppen szintetizálódó DNS-láncba beépült-e az adott futtatásnál hozzáadott nukleotid. Ha igen, az azt jelenti, hogy a lánc aktuális pozíciójában ez a nukleotid foglal helyet.

Mivel egy-egy futtatásnál mindig csak egyféle bázis épülhet be, a fényfelvillanásokból - egy kirakósjáték darabjaihoz hasonlóan - végül összerakható, hogy a csövecskékben milyen bázissorrendű DNS-lánc képződött. Ha a kiindulási mintánk a vizsgált DNS szakasz több variánsát is tartalmazta, vagy egyszerre több DNS szakaszt vizsgálunk, akkor a cellák is több különféle DNS változatot fognak tartalmazni. Így a felvillanások a vizsgálótálcán bonyolult tér- és időbeli mintázatot alkotnak, amelyet egy nagyteljesítményű számítógép elemez ki a reakciót követően. A folyamat során hatalmas mennyiségű adat kerül feldolgozásra néhány óra leforgása alatt. (A folyamat lépései például ebben az angol nyelvű multimédiás prezentációban tekinthetőek meg.)

Miben jelentenek előrelépést az új generációs genomszekvenátorok?

Az új generációs (next-generation) szekvenátorok hatalmas teljesítménnyel rendelkeznek az eddigi szekvenáló-rendszerekhez képest. A modern berendezésekkel akár több millió, egyenként néhányszor tíz vagy néhány száz bázispárból álló DNS-szakasz sorrendje határozható meg egy menetben, ennek időigénye berendezéstől és a DNS szakasz hosszától függően néhány óra, esetleg néhány nap.

Bár az eljárás egy egyén teljes genetikai állományának bázissorrend-meghatározására is felhasználható, ez ma még nem tekinthető általános alkalmazásnak. Mindez ugyanis igen költségigényes lenne, arról pedig egyelőre élénk vita zajlik a szakemberek között, hogy mikor van valóban szükség a teljes genetikai állomány vizsgálatára. Ezért, amíg a szekvenálómódszerek nem válnak olcsóbbá (amire egyébként számítani lehet a jövőben), addig főleg bizonyos gének, vagy hosszabb DNS-darabok elemzésére fogják használni ezeket az eszközöket.

Hazánkban jelenleg három intézetben működik nagy teljesítményű új generációs szekvenátor: egy ABI Solid típusú Szegeden, kettő Roche GS FLX Titanium Budapesten. Két, ezeknél kisebb (tized akkora) teljesítményű, Roche GS Juniornak nevezett eszköz Debrecenben, illetve Budapesten üzemel.

A szegedi Baygen Intézetben a Solid készülékkel főként külső megbízásra végeznek szekvenálásokat. Az Országos Onkológiai Intézetben többek között az öröklődő tumortípusok kialakulását vizsgálják a GS FLX Titaniummal egy nemrég indított kutatási program keretein belül, a szintén budapesti székhelyű KPS Orvosi Biotechnológiai és Egészségügyi Szolgáltató Kft. szakemberei pedig elsősorban úgynevezett farmakodiagnosztikai vizsgálatokra használnak egy ugyanilyen készüléket. Ez utóbbi alkalmazás során tumormintákban olyan génszakaszok jelenlétét vagy hiányát vizsgálják, amelyek indikálják, hogy egy adott daganatellenes készítmény hatásos-e a vizsgált tumor esetében vagy sem. Ez alapján képesek genetikai információkat szolgáltatni az adott beteg számára leghatékonyabb terápia kiválasztásához.
Az Országos Onkológiai Intézet nemrég üzembe helyezett készülékéről kapcsolódó anyagunkban olvashat bővebben: Genetikai szűrés lehetősége az Országos Onkológiai Intézetben. A farmakodiagnosztikáról a közeljövőben jelentetünk meg részletes
ismertetőt.

Tisztelt Olvasónk! Felhívjuk a figyelmét, hogy anyagaink tájékoztató és ismeretterjesztő jellegűek, így nem adhatnak választ minden olyan kérdésre, amely egy adott betegséggel vagy más témával kapcsolatban felmerülhet, és főképp nem pótolhatják az orvosokkal, gyógyszerészekkel vagy más egészségügyi szakemberekkel való személyes találkozást, beszélgetést és gondos kivizsgálást.

Hírek az Avemarról:

Ajánló